人外周血白細(xì)胞分離液發(fā)展現(xiàn)狀發(fā)展趨向自主創(chuàng)新
人外周血白細(xì)胞分離液試劑盒嚴(yán)格按照人外周血白細(xì)胞分離液試劑盒說明書進(jìn)行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min，加樣后及時放人孵箱。標(biāo)本較多時，要分批操作，按說明步驟嚴(yán)格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*。
人外周血白細(xì)胞分離液封板溫育時，各孔一定要封嚴(yán)，防止陽性標(biāo)本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)，用洗板機(jī)洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。合理安排人外周血白細(xì)胞分離液檢測量，以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長，加酶試劑后用吸水紙在酶標(biāo)板表面輕拭吸干，顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用。人外周血白細(xì)胞分離液加樣時保持顯色劑不外流，避免接觸金屬器械。加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
人外周血白細(xì)胞分離液應(yīng)保證清潔，整個操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至zui低限度。從而提高檢測的特異性。并得到更準(zhǔn)確、可靠的實驗結(jié)果。人外周血白細(xì)胞分離液僅用于科研實驗，禁用于臨床。人外周血白細(xì)胞分離液效果很好，分離步驟如下：
1.在離心管中加入人外周血白細(xì)胞分離液。
2.取肝素抗凝靜脈血與等量生理鹽水充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。
3. 離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和生理鹽水，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為人外周血白細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板。
4. 用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個核細(xì)胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的生理鹽水，1500rpm×10分鐘，洗滌細(xì)胞兩次。
5. 末次離心后，棄上清，此時PBMC即可用來提取RNA了。如果此時不想立即提取的話，建議你－80度保存，因為細(xì)胞內(nèi)RNA容易降解,所以一般在PBMC提取出來后立即進(jìn)行RNA提取。如果因為人外周血白細(xì)胞分離液少,想積攢一批樣本后進(jìn)行提取的話,PBMC的保存應(yīng)該注意了,不然就會降解的.一般降PBMC放置-80讀保存.如果你提取用的是Trizon,此時應(yīng)將Trizon試劑一起加到PBMC中保存.RNA提出后,應(yīng)該先測一下OD值,然后再跑一下電泳,這是檢驗RNA的純度和完整性,這是保證逆轉(zhuǎn)錄成功的前體,不然的話后面就會坐無用功了.
