MeRIP-seq RNA m6A甲基化測(cè)序
- 公司名稱 深圳市易基因科技有限公司
- 品牌 其他品牌
- 型號(hào) MeRIP-seq
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
- 更新時(shí)間 2025/4/17 16:53:45
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m6A是RNA上豐富的一種修飾，平均每條轉(zhuǎn)錄本有1~3個(gè)m6A修飾。易基因MeRIP-seq技術(shù)利用m6A特異性抗體富集發(fā)生m6A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結(jié)合高通量測(cè)序，可以對(duì)RNA上的m6A修飾進(jìn)行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，僅需1μg總RNA。廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域；可應(yīng)用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m6A檢測(cè)。
大樣本量m6A-QTL性狀關(guān)聯(lián)分析，傳統(tǒng)MeRIP單個(gè)樣品價(jià)格高，通常難以承擔(dān)。易基因開發(fā)建立MeRIP-seq2技術(shù)，顯著提成IP平行性，實(shí)現(xiàn)不同樣本間相對(duì)定量，降低檢測(cè)成本。
易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術(shù)：
? m6A甲基化-常量mRNA 甲基化測(cè)序（MeRIP-seq）
? m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（lnc-MeRIP-seq）
? m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
? 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化測(cè)序（MeRIP-seq2）
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
? 起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，僅需1μg總RNA；
? 轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)：可以同時(shí)檢測(cè)mRNA和lncRNA；
? 樣本要求：可用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m6A檢測(cè)；
? 重復(fù)性高：IP富集重復(fù)性高，降低抗體富集偏差
? 應(yīng)用范圍廣：廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥的發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要運(yùn)用在分子機(jī)制的理論性研究
? 疾病發(fā)生發(fā)展：腫瘤、代謝疾?。ㄈ绶逝?span>/糖尿?。?、神經(jīng)和精神疾?。ㄈ绨柶澓ＤY/抑郁癥）、炎癥…
? 發(fā)育和分化：早期胚胎發(fā)育、個(gè)體/組織/器官生長(zhǎng)發(fā)育、干細(xì)胞分化與命運(yùn)決定、衰老
? 環(huán)境暴露與響應(yīng)：污染、抗逆、生活方式
技術(shù)路線：
RNA樣品→文庫(kù)構(gòu)建→上機(jī)測(cè)序→數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)策略：
材料選取 → RNA提取→RNA片段化→抗體富集→反轉(zhuǎn)錄得cDNA文庫(kù)→接頭連接
→PCR擴(kuò)增→文庫(kù)制備→上機(jī)測(cè)序
圖：微量MeRIP-seq實(shí)驗(yàn)流程
分析內(nèi)容：
MeRIP-seq分析內(nèi)容 | |
標(biāo)準(zhǔn)分析 | 質(zhì)控及及評(píng)估： 1、 數(shù)據(jù)質(zhì)控 2、 比對(duì)統(tǒng)計(jì) 3、 插入片段長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì) 4、 全基因組覆蓋度統(tǒng)計(jì) 5、 樣本飽和度曲線 |
m6A富集區(qū)域（peak）的鑒定及統(tǒng)計(jì)： 1、 m6A富集區(qū)域（peak）的鑒定與注釋 2、 m6A富集區(qū)域的基本統(tǒng)計(jì) 3、 m6A富集區(qū)域在染色體上的分布 4、 m6A富集區(qū)域在基因元件上的分布 5、 m6A富集區(qū)域關(guān)聯(lián)基因的功能富集分析 6、 m6A富集區(qū)域在基因元件上的分布密度 7、 m6A修飾區(qū)域的motif鑒定 8、 特定基因峰圖展示 | |
差異m6A修飾的鑒定及統(tǒng)計(jì)： 1、 組內(nèi)樣本peak重疊情況分析 2、 組內(nèi)樣本peak關(guān)聯(lián)基因的重疊情況分析 3、 差異m6A修飾的鑒定與注釋 4、 差異m6A修飾的基本統(tǒng)計(jì) 5、 差異m6A修飾在染色體上的分布 6、 差異m6A修飾在基因元件上的分布 7、 差異m6A修飾關(guān)聯(lián)基因的富集分析 8、 差異m6A修飾在基因元件上的分布密度 9、 差異m6A修飾區(qū)域的motif鑒定 | |
表達(dá)水平分析： 1、 lncRNA鑒定 2、 circRNA鑒定 3、 基因表達(dá)水平分析 4、 基因表達(dá)水平密度分析 5、 基于表達(dá)譜的聚類分析 6、 基于表達(dá)譜的主成分分析 7、 基于表達(dá)譜的相關(guān)性分析 | |
差異表達(dá)基因鑒定及富集分析： 1、 差異表達(dá)基因鑒定 2、 差異基因功能富集分析 | |
差異m6A修飾及差異基因關(guān)聯(lián)分析 | |
注：個(gè)性化分析、多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析請(qǐng)聯(lián)系對(duì)接銷售或技術(shù)支持 | |
送樣要求：
送樣要求 | 項(xiàng)目周期 |
? 樣本類型：去蛋白并進(jìn)行DNase處理后的完整總RNA樣本 ? 樣本總量：≥10μg ? 樣本濃度：建議≥250 ng/μL ? 樣本完整度：RIN ≥ 7，Ratio 28S/18S ≥ 0.7；某些來源樣本（如體液樣本，昆蟲樣本，水生生物樣本等）無RIN和Ratio28S/18S要求 | 20個(gè)樣本以下標(biāo)準(zhǔn)流程的運(yùn)轉(zhuǎn)周期約為36個(gè)工作日。遇到樣本數(shù)目較多時(shí)，項(xiàng)目周期需要與技術(shù)支持人員確定。 |
技術(shù)選擇：
主流m6A檢測(cè)技術(shù)：
? MeRIP-seg：基于IP富集技術(shù)，該技術(shù)包括IP和input兩個(gè)文庫(kù)，兩個(gè)文庫(kù)結(jié)合起來分析可以得到m6A修飾圖譜，單獨(dú)的input文庫(kù)可視為RNA-seq文庫(kù)，可用于進(jìn)行表認(rèn)圖譜的分析。
? 微量MeRIP-seq：優(yōu)化MeRIP-seq的RNA擴(kuò)增建庫(kù)步驟，能夠適用更低起始量材料。采用去rRNA方法建庫(kù)，能夠檢測(cè)mRNA和非編碼RNA的m6A修飾。
? miCLIP-seq：基于紫外交聯(lián)和IP技術(shù)，實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率檢測(cè)，利用C-T突變來準(zhǔn)確識(shí)別m6A修飾位點(diǎn)，可以在同一個(gè)峰內(nèi)檢測(cè)多個(gè)m6A位點(diǎn)。
? MAZTER-seq：基于MazF酶切富集ACA序列，檢測(cè)的是富含ACA位點(diǎn)的m6A修飾片段，無法檢測(cè)其他m6A修飾類型。近距離的ACA修飾類型也無法區(qū)分。
? MeRIP-gPCR：靶向特定區(qū)域進(jìn)行m6A修飾測(cè)定，比較準(zhǔn)確。需要全甲基化和全不甲基化的標(biāo)準(zhǔn)品加入。
? MeRIP-seq和微量MeRIP-seq用于轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)研究探索，并篩選目標(biāo)基因。
? MeRIP-qPCR用于后續(xù)目標(biāo)基因的甲基化驗(yàn)證。
經(jīng)典案例
項(xiàng)目文章：
縱向轉(zhuǎn)錄組分析揭示了m6A甲基化修飾在豬胚胎期骨骼肌發(fā)育中的重要作用
Zhang X,et al.Longitudinal epitranscriptome profiling reveals the crucial role of N6-methyladenosine methylation in porcine prenatal skeletal muscle development. J Genet Genomics. 2020 Aug;47(8):466-476.
背景
m6A是豐富的一類mRNA修飾，可以促進(jìn)骨骼肌的發(fā)育。然而m6A甲基化在胚胎期骨骼肌生成中的狀態(tài)和功能仍不清楚。
方法
研究人員首先證明METTL14（一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶）沉默可抑制成肌細(xì)胞的分化，促進(jìn)C2C12 成肌細(xì)胞增殖。采用m6A-seq（MeRIP-seq）測(cè)序方法，對(duì)豬骨骼肌發(fā)育六個(gè)胚胎期的縱向轉(zhuǎn)錄組和表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜進(jìn)行分析。
結(jié)論
MeRIP-seq結(jié)果顯示：胚胎期骨骼肌發(fā)育六個(gè)不同階段的m6A修飾呈現(xiàn)高度的動(dòng)態(tài)變化，且大多數(shù)受影響的基因在與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的通路中富集。IGF2BP1 RIP-seq證實(shí)了胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白1(IGF2BP1)靶向與骨骼肌發(fā)育相關(guān)通路的76個(gè)基因，包括關(guān)鍵肌肉發(fā)育標(biāo)記基因MYH2和MyoG。此外 siRNA介導(dǎo)的 IGF2BP1沉默可抑制成肌細(xì)胞分化，促進(jìn)其增殖，類似于METTL14 沉默所觀察到的表觀遺傳變化。本研究不僅闡明了肌肉發(fā)育中m6A甲基化的動(dòng)力學(xué)，且確定了參與豬胚胎期骨骼肌發(fā)育基因表達(dá)的關(guān)鍵基因。
圖：胚胎期骨骼肌發(fā)育六個(gè)不同階段的縱向轉(zhuǎn)錄組和表觀轉(zhuǎn)錄組表征
參考文獻(xiàn)：
① Zhang X,et al.Longitudinal epitranscriptome profiling reveals the crucial role of N6-methyladenosine methylation in porcine prenatal skeletal muscle development. J Genet Genomics. 2020 Aug;47(8):466-476.
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