核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時，可使DNA附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內(nèi)，進入細胞的DNA僅有1%～5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進行穩(wěn)定表達，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項技術(shù)能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉(zhuǎn)化的研究。此方法對于貼壁細胞轉(zhuǎn)染是zui常用并的方法。 

1、配液 

(1)2×HBS 1.63g NaCl 

1.19g Hepes 

0.023g Na2PO4、2H2O 

加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存 

(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌 

(3)TE：0.1mmol/L EDTA 

1mmol/L Tris-HCL PH8.0 

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL過濾除菌4℃保存。

(5)G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200～ 800mg/L 

注意：對受體細胞先做預(yù)試驗，選用濃度為在10～14天內(nèi)能殺死細胞50%以上的zui低濃度。 

2、操作步驟[方法一]： 

(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。 

(2)受體細胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等，該細胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向，一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細胞，接種密度為2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，待細胞占50～70%瓶底面積時，用于轉(zhuǎn)染試驗。 

(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備 

①將供體細胞DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時向供體細胞DNA液.200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混勻30秒。 

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細胞。 

(4)轉(zhuǎn)染受體細胞 

①將處于對數(shù)生長期已占瓶底50～70%的受體細胞，在轉(zhuǎn)染前4小時更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml（25ml培養(yǎng)瓶）。 

②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養(yǎng)液的細胞瓶中搖勻。 

③置37℃ 5% CO2培養(yǎng)24h或更長，使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結(jié)晶顆粒。 

④更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達。 

⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進行篩選。同時設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對照細胞。 

⑥培養(yǎng)大約3～5天，對照細胞大部分死亡，這時轉(zhuǎn)染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每3～4天更換一次選擇培養(yǎng)基。 

⑦2周后對照細胞死亡，在轉(zhuǎn)染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆出現(xiàn)，待其增大后再進行克隆化和擴大培養(yǎng)，可建立轉(zhuǎn)化細胞株，并做進一步鑒定。