線粒體和細胞核的制備與觀察

利用細胞核與線粒體在一定介質(zhì)中的沉降速度的差異，可采取分級差速離心的方法，將細胞核與線粒體逐級分離出來。（差速離心技術(shù)）

線粒體是真核細胞*的進行能量轉(zhuǎn)換的重要細胞器。將動植物組織制成勻漿，在適當?shù)膽腋〗橘|(zhì)中差速離心法可以分離細胞線粒體。在一定的離心場中（選用離心機的一定轉(zhuǎn)速），球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻的懸浮介質(zhì)中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器沉降先后順序先后是細胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。

懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性；pH7.2的條件下，亞細胞組分不容易聚集成團，有利于分離。整個操作過程樣品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。

細胞器標記酶的測定是評價細胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色，從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。

詹納斯綠B是一種活體染料，能對動植物的細胞或組織在活體狀態(tài)下進行無毒害的染色。由于染料（堿性染料）的膠粒表面帶有陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染部分本身具有陽離子或陰離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料就被堆積下來。染色法可以顯示出活細胞內(nèi)的某種天然結(jié)構(gòu)存在的真實性，而不影響細胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學變化以引致細胞的死亡。

Gimesa是一種復合染料，即為酸性染料與堿性染料的結(jié)合物。在水溶液中電離為帶正電和負電的染料離子。

***材料： 鼠肝臟， 豬肝臟

***試劑：
　　（1）0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖液（pH7.4）
　　0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液10ml
　　0.1mol/L鹽酸8.4ml
　　加雙蒸水到100ml，再加蔗糖使?jié)舛葹?.2mol/L

（2） 0.34mol/L蔗糖-0.01mol/LTris-鹽酸緩沖液（pH7.4），配法同上。

（3） 1%詹納斯綠B（Janus green 染液，稱取50mg（pH7.4），詹納斯綠B溶于5ml生理鹽水中，稍微加熱使之溶解后，過濾，即為1%原液。

（4） 姬姆薩染液（Giemsa）：稱取姬姆薩粉0.5g，甘油33 ml 、純甲醇33ml。先在姬姆薩粉中添加少量甘油，然后在研缽內(nèi)研磨至無顆粒狀，再將剩余甘油倒入混勻，56℃左右保溫2h使其充分溶解，zui后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。使用時吸出少量，用1/5mol/L磷酸緩沖液作10~20倍稀釋。

（5） 1/15 mol/L磷酸緩沖液?（pH6.8）
　　1/15 mol/ L磷酸二氫鉀 （KH2PO4）50 ml
　　1/15 mol/ L磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 50 ml

卡諾（Cornay）固定液：無水乙醇 6 ml 冰醋酸 1 ml 氯仿 3 ml