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超濾離心管操作全解析：從離心參數(shù)到回收率提升的實(shí)戰(zhàn)指南
一、超濾離心管離心參數(shù)優(yōu)化
轉(zhuǎn)速與時(shí)間
初次離心建議以推薦轉(zhuǎn)速的70%起步(如3000×g離心10分鐘)，觀察流速后逐級(jí)調(diào)整至4000×g，但不得超過(guò)濾膜耐受極限。
典型處理時(shí)間為10-30分鐘，具體取決于截留分子量(MWCO)和樣本體積。
溫度控制
離心機(jī)需預(yù)冷至4℃，減少熱變性吸附。低溫環(huán)境可延長(zhǎng)膜使用壽命，但需注意濃縮時(shí)間可能延長(zhǎng)。
加速度與平衡
離心加速度調(diào)至最低檔，減小對(duì)膜的壓力。
確保配對(duì)的超濾管質(zhì)量與重心平衡，濾芯的放置位置和方向一致，避免離心過(guò)程中晃動(dòng)或損壞。
二、回收率提升策略
濾膜選擇與預(yù)處理
根據(jù)目標(biāo)分子量選擇MWCO比目標(biāo)分子小2-3倍的超濾膜。例如，目標(biāo)蛋白分子量為35kDa時(shí)，選擇10kDa截留分子量的超濾管。
新購(gòu)超濾離心管的超濾膜含有微量甘油，使用前需用純水或緩沖液浸泡并置于冰箱預(yù)冷10分鐘。之后倒出純水，再將超濾管置于冰上預(yù)冷2-5分鐘。
樣本處理與加樣
樣本提前用0.22μm濾膜過(guò)濾，避免顆粒物堵塞超濾膜。
將樣本緩慢加入超濾管，液面不超過(guò)最大標(biāo)線。加樣時(shí)操作要輕，避免破壞膜結(jié)構(gòu)。
濃縮與洗脫
離心過(guò)程中每5分鐘暫停，用移液槍輕柔吹打截留層，防止大分子堆積形成濃差極化層。
截留體積控制在原始樣本量的1/10至1/20。濃縮倍數(shù)過(guò)高易導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，可在超濾中途添加緩沖液進(jìn)行置換，分階段濃縮。
對(duì)于黏稠樣本(如含甘油或蔗糖)，需降低轉(zhuǎn)速10%-20%，延長(zhǎng)離心時(shí)間。
回收操作
離心后，大分子留在上層，小分子和溶劑通過(guò)膜進(jìn)入下層。外管濾液為小分子物質(zhì)和溶劑；內(nèi)管液體為大分子物質(zhì)。
如需收集大分子物質(zhì)，則另取外管，內(nèi)管倒置1000×g離心1-2分鐘。
三、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
漏蛋白或檢測(cè)不到蛋白
原因：濾膜選擇不當(dāng)、離心參數(shù)不合適、樣本初始濃度過(guò)低等。
解決方案：重新選擇合適的MWCO濾膜，調(diào)整離心參數(shù)，確保樣本初始濃度大于25μg/ml。
膜堵塞或流速過(guò)慢
原因：樣本中顆粒物過(guò)多、濾膜污染等。
解決方案：樣本提前過(guò)濾，定期清洗或更換濾膜。發(fā)現(xiàn)膜堵塞時(shí)，用0.1M NaOH浸泡1小時(shí)，再用純水沖洗三次。
回收率低
原因：濾膜吸附性、操作不當(dāng)?shù)取?br />
解決方案：提前用1% BSA封閉濾膜30分鐘，減少非特異性吸附。操作時(shí)注意輕柔，避免破壞膜結(jié)構(gòu)。
超濾后截留液出現(xiàn)沉淀
原因：蛋白質(zhì)濃度過(guò)高、Buffer不合適等。
解決方案：用多根超濾管同時(shí)超濾，降低濃度；換不同的Buffer，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。對(duì)于沉淀，可用8M尿素溶解后再次離心。
四、維護(hù)與保養(yǎng)
清洗與消毒
一次性使用的超濾離心管，使用后直接丟棄。
如需重復(fù)使用，使用完的超濾管用純水反復(fù)清洗5次，再用0.1M NaOH浸泡1-2小時(shí)，隨后用20%乙醇清洗，并用超純水或緩沖液清洗3次。一般不建議重復(fù)使用超濾管超過(guò)5次。
長(zhǎng)期保存
短期保存：用0.1M NaOH浸泡1-2小時(shí)，純水清洗3次，然后用75%乙醇浸泡，務(wù)必使濾膜保持濕潤(rùn)，不能長(zhǎng)菌。
長(zhǎng)期保存：用0.1M NaOH浸泡1-2小時(shí)，純水清洗3次，然后用20%乙醇浸泡，務(wù)必使濾膜保持濕潤(rùn)，不能長(zhǎng)菌。
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