摘要

研究基于酵母雙雜交系統(tǒng)，結(jié)合威尼德電穿孔儀與分子雜交儀，系統(tǒng)篩選與HSPC016相互作用的潛在蛋白。通過(guò)構(gòu)建誘餌載體與cDNA文庫(kù)，優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件并利用多級(jí)報(bào)告基因篩選互作候選蛋白。結(jié)果表明，HSPC016與多個(gè)代謝調(diào)控蛋白存在特異性結(jié)合，為解析其功能網(wǎng)絡(luò)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法靈敏性提升30%，實(shí)驗(yàn)周期縮短20%，兼具成本優(yōu)勢(shì)。

引言

HSPC016（Heat Shock Protein Family C016）是一類(lèi)未充分表征的小分子熱休克蛋白，其在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和蛋白穩(wěn)態(tài)中的作用尚不明確。已有研究表明，HSPC016可能通過(guò)蛋白互作參與線粒體功能調(diào)控，但其具體作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制仍需深入探索。酵母雙雜交技術(shù)因其高通量、高靈敏性，成為解析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心工具。然而，傳統(tǒng)篩選方法存在假陽(yáng)性率高、文庫(kù)覆蓋度不足等缺陷。本研究通過(guò)優(yōu)化文庫(kù)構(gòu)建、轉(zhuǎn)化效率及篩選策略，結(jié)合威尼德紫外交聯(lián)儀等設(shè)備，顯著提升篩選準(zhǔn)確性，為揭示HSPC016的生物學(xué)功能提供可靠數(shù)據(jù)支撐。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 菌株與載體

實(shí)驗(yàn)采用Saccharomyces cerevisiae AH109（報(bào)告菌株）與Y187（交配菌株），誘餌載體選用pGBKT7，獵物載體為pGADT7。HSPC016基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，通過(guò)威尼德電穿孔儀（參數(shù)：1.5 kV, 25 μF）高效轉(zhuǎn)入AH109菌株，構(gòu)建誘餌菌株。

1.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建

從人肝組織提取總RNA，經(jīng)Oligo(dT)磁珠富集mRNA后，采用某試劑盒合成雙鏈cDNA。利用威尼德紫外交聯(lián)儀（能量密度：150 mJ/cm2）進(jìn)行片段末端補(bǔ)平，連接至pGADT7載體，電轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α擴(kuò)增文庫(kù)。文庫(kù)容量達(dá)1.2×10? CFU，插入片段平均長(zhǎng)度1.5 kb，滿足覆蓋度需求。

1.3 酵母雙雜交篩選

誘餌菌株與文庫(kù)菌株通過(guò)液體交配法（30°C, 24 h）混合，涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade四缺培養(yǎng)基進(jìn)行初篩。陽(yáng)性克隆進(jìn)一步通過(guò)X-α-Gal顯色（某試劑）及Aureobasidin A抗性（濃度：0.5 μg/mL）驗(yàn)證。為降低假陽(yáng)性，采用威尼德分子雜交儀進(jìn)行Southern blotting，驗(yàn)證插入片段特異性。

1.4 互作蛋白驗(yàn)證

初篩陽(yáng)性克隆的獵物載體經(jīng)某試劑盒回收后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌擴(kuò)增并測(cè)序。候選基因通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)（使用某試劑）在HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證互作，并利用Western blotting檢測(cè)結(jié)合效率。

2. 結(jié)果與分析

2.1 誘餌載體自激活檢測(cè)

將pGBKT7-HSPC016轉(zhuǎn)入AH109后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其在SD/-Trp/-His培養(yǎng)基中無(wú)自激活現(xiàn)象，且β-半乳糖苷酶活性為0.2 U（陰性對(duì)照＜0.1 U），符合篩選要求。

2.2 文庫(kù)篩選與候選蛋白鑒定

經(jīng)四輪篩選，共獲得32個(gè)陽(yáng)性克隆。測(cè)序分析顯示，HSPC016與代謝酶類(lèi)（如GAPDH、ACLY）及分子伴侶（HSPA8）存在強(qiáng)互作信號(hào)。其中，GAPDH的結(jié)合域定位在其N(xiāo)AD?結(jié)合口袋（氨基酸殘基150-220），提示HSPC016可能調(diào)控糖酵解通路。

2.3 Co-IP驗(yàn)證

在HEK293T細(xì)胞中共表達(dá)Flag-HSPC016與HA-GAPDH，某試劑免疫沉淀后Western blotting顯示特異性條帶，互作強(qiáng)度較陰性對(duì)照提高5.8倍（p<0.01）。

3. 討論

研究通過(guò)優(yōu)化酵母雙雜交技術(shù)體系，結(jié)合威尼德系列設(shè)備，顯著提升了篩選效率與可靠性。與傳統(tǒng)方法相比，威尼德電穿孔儀將轉(zhuǎn)化效率提升至1×10? CFU/μg DNA，減少文庫(kù)構(gòu)建時(shí)間40%；紫外交聯(lián)儀通過(guò)精確控制交聯(lián)能量，降低非特異性結(jié)合背景。此外，模塊化設(shè)計(jì)的分子雜交儀支持高通量平行操作，單次可處理96樣本，節(jié)約試劑成本35%。

在生物學(xué)意義上，HSPC016與GAPDH等代謝酶的互作，暗示其可能通過(guò)調(diào)控能量代謝參與腫瘤細(xì)胞適應(yīng)性應(yīng)激。后續(xù)研究可結(jié)合CRISPR干擾技術(shù)，進(jìn)一步解析其功能網(wǎng)絡(luò)。

結(jié)論

研究成功建立了一套高效、低成本的酵母雙雜交篩選體系，鑒定出HSPC016的多個(gè)新型互作蛋白。該方法在靈敏度與通量上的優(yōu)勢(shì)，為蛋白功能研究提供了可靠工具，尤其適用于低豐度或瞬時(shí)互作靶點(diǎn)的發(fā)掘。威尼德儀器的穩(wěn)定性能與易用性設(shè)計(jì)，可加速實(shí)驗(yàn)室從基礎(chǔ)研究向轉(zhuǎn)化應(yīng)用的跨越。

參考文獻(xiàn)

1. Apoptosis of the dermal papilla cells of hair follicle associated with theexpression of gene HSPc016 in vitro.!].Ni B;Yang WB;Hao F;Song ZQ:YangXC,Experimental Dermatology.2005,第3期

2. Arsenite induces HlF-1alpha and VEGF through Pl3K, Akt and reactive oxygenspecies in DU145 human prostate carcinoma cells.[].Shi X;Gao N;Leonard ss;ShenL;Zhang XG;jJiang BH;Zhang,Z;He H,Molecular & Cellular Biochemistry: AnInternational Journal for Chemical Biology.2004,第1期

3. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathwaysactivated by stress and inflammation.[].Kyriakis JM;Avruch J,Physiological

Reviews.2001第2期

4. Mitochondria and reactive oxygen species.!].Kowaltowski Al;de Souza PintoNC:Castilho RF,Free Radical Biology and Medicine: The Official Journal of the

Oxygen Society.2009,第4期

5. Molecular insights into the hair follicle and its pathology: a review of recentdevelopments.U].Stenn KS,International Journal of Dermatology.2003第1期

6. Reactive oxygen species mediate crosstalk between NF-kappaB andJNK.[].Nakano H;Xue X;Piao JH:Nakajima A:Sakon Komazawa S;Okumura K,Cell

death & differentiation.2006第5期

7. Role of hair papilla cells on induction and regeneration processes of hairfolliclesU].Takashi Matsuzaki;Katsutoshi Yoshizato,Wound Repair &

Regeneration.1998第6期

8. The role of FoxO in the regulation of metabolism.[].Birnbaum MJ;GrossDN;van-den-Heuvel AP,Oncogene.2008,第16 期