摘要

通過系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔參數(shù)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染比例及外源DNA濃度，顯著提升了山羊胎兒成纖維細(xì)胞中外源基因的整合效率。實(shí)驗(yàn)表明，電穿孔條件為電壓150 V、脈沖時(shí)長(zhǎng)10 ms時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)42.5%；聯(lián)合優(yōu)化脂質(zhì)體比例（1:3）及DNA濃度（4 μg/mL）后，整合效率提升至58.3%。研究結(jié)果為高效制備轉(zhuǎn)基因山羊體細(xì)胞提供了可靠技術(shù)方案。

引言

外源基因轉(zhuǎn)染與整合效率是體細(xì)胞克隆與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。山羊胎兒成纖維細(xì)胞（GFb）作為核移植常用供體細(xì)胞，其基因編輯效率直接影響后續(xù)胚胎發(fā)育成功率。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法存在整合率低、細(xì)胞毒性高等問題，亟需建立穩(wěn)定高效的優(yōu)化體系。

聚焦電穿孔與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染兩大技術(shù)，通過參數(shù)梯度設(shè)計(jì)，系統(tǒng)探究電壓、脈沖時(shí)長(zhǎng)、脂質(zhì)體/DNA比例及外源DNA濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響，并采用熒光標(biāo)記、qPCR及Southern blot驗(yàn)證整合穩(wěn)定性，旨在為轉(zhuǎn)基因山羊研究提供高效、低損傷的細(xì)胞改造方案。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞系：山羊胎兒成纖維細(xì)胞（GFb），取自3月齡流產(chǎn)胎兒，經(jīng)膠原酶消化法分離培養(yǎng)。

外源基因載體：pEGFP-N1質(zhì)粒（某試劑），攜帶綠色熒光蛋白（GFP）及新霉素抗性基因。

儀器：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯(lián)儀、威尼德分子雜交儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
實(shí)驗(yàn)分為三部分：

電穿孔參數(shù)優(yōu)化：設(shè)置電壓梯度（80 V、120 V、150 V、180 V）及脈沖時(shí)長(zhǎng)（5 ms、10 ms、15 ms），每組重復(fù)3次。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染比例優(yōu)化：脂質(zhì)體（某試劑）與DNA質(zhì)量比設(shè)為1:1、1:2、1:3、1:4，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率及GFP表達(dá)量。

DNA濃度優(yōu)化：外源DNA濃度梯度為2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL，評(píng)估整合效率與細(xì)胞毒性關(guān)系。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞培養(yǎng)與預(yù)處理：GFb細(xì)胞于DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染前24 h調(diào)整密度至5×10^5 cells/mL。

電穿孔轉(zhuǎn)染：取1 mL細(xì)胞懸液與4 μg質(zhì)?；旌希尤胪岬码姶┛變x專用電擊杯，按預(yù)設(shè)參數(shù)處理，后續(xù)培養(yǎng)48 h觀察熒光表達(dá)。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：按比例混合脂質(zhì)體與質(zhì)粒，靜置20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃孵育6 h更換培養(yǎng)基。

整合效率檢測(cè)：

熒光顯微鏡計(jì)數(shù)：統(tǒng)計(jì)GFP陽性細(xì)胞比例；

流式細(xì)胞術(shù)：定量分析轉(zhuǎn)染效率；

qPCR與Southern blot（威尼德紫外交聯(lián)儀、分子雜交儀）：驗(yàn)證外源基因整合位點(diǎn)及拷貝數(shù)。

2. 結(jié)果與分析

2.1 電穿孔參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響
電壓150 V、脈沖時(shí)長(zhǎng)10 ms時(shí)，GFb細(xì)胞存活率最高（89.2%），轉(zhuǎn)染效率達(dá)42.5%；高于180 V時(shí)細(xì)胞損傷顯著（存活率＜60%）。

2.2 脂質(zhì)體/DNA比例優(yōu)化
脂質(zhì)體與DNA質(zhì)量比1:3時(shí)，GFP表達(dá)率最高（48.7%），且細(xì)胞毒性低（存活率92.1%）。

2.3 DNA濃度與整合效率關(guān)系
外源DNA濃度為4 μg/mL時(shí)，Southern blot檢測(cè)顯示單拷貝整合占比68.3%，高于高濃度組（6-8 μg/mL）的多拷貝隨機(jī)整合現(xiàn)象。

2.4 聯(lián)合優(yōu)化效果
綜合合理參數(shù)（電穿孔150 V/10 ms + 脂質(zhì)體1:3 + DNA 4 μg/mL），轉(zhuǎn)染效率提升至58.3%，且外源基因穩(wěn)定整合率提高1.8倍。

討論

電穿孔參數(shù)中適中的電壓與脈沖時(shí)長(zhǎng)可平衡細(xì)胞膜通透性與存活率，而脂質(zhì)體比例優(yōu)化能有效提升DNA-載體復(fù)合物穩(wěn)定性。威尼德電穿孔儀的高精度脈沖控制及紫外交聯(lián)儀的均勻交聯(lián)特性，為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性提供了保障。此外，某試劑脂質(zhì)體的低細(xì)胞毒性特性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑。

值得注意的是，外源DNA濃度過高易導(dǎo)致多拷貝隨機(jī)整合，可能干擾靶基因功能。因此，4 μg/mL為本實(shí)驗(yàn)推薦閾值。

結(jié)論

通過系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及DNA濃度參數(shù)，本研究成功將山羊體細(xì)胞外源基因整合效率提升至58.3%，為轉(zhuǎn)基因山羊制備提供了高效技術(shù)方案。威尼德系列儀器的穩(wěn)定性能與某試劑的高兼容性是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵支撐。未來將進(jìn)一步驗(yàn)證該體系在大型動(dòng)物基因編輯中的普適性。

參考文獻(xiàn)

1. 影響水牛胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的因素[J].崔奎青;劉慶友;湯剛彬;謝體三;石德順,中國(guó)畜牧雜志.2008,第19期

2. 人轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)基因克隆牛整合位點(diǎn)檢測(cè)[J].劉宇;朱怡文;許淼;黃英,中國(guó)畜牧獸醫(yī).2012,第2期

3. 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染研究[J].張艷麗;許丹;龐訓(xùn)勝;萬永杰;王子玉;孟立;宋輝;王鋒,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2010,第1期

4. 山羊β酪蛋白基因克隆及序列分析[J].王強(qiáng);陳美玨;任兆瑞;黃淑幀;曾溢滔,中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào).2003,第1期

5. Bovine prolactin promotes the expression of human transferrin in the milk of transgenic mice[J].Ren; Zhaorui;Huang; Ying;Gong; Xiuli;Xu; Miao;Guo; Xinbing;Yan; Jingbin;Li; Song,Biotechnology Letters.2010,第6期

6. Critical assessment of the nuclear import of plasmid during cationic lipid-mediated gene transfer[J].Virginie Escriou;Marie Carriere;Pierre Wils;Florence Bussone;Daniel Scherman,The Journal of Gene Medicine.2001,第2期