前言

在當今的生物技術領域，高通量重組蛋白表達技術在基礎研究和商業(yè)應用中扮演著非常重要的角色。隨著后基因組時代的到來，研究人員對大規(guī)模蛋白表達和純化的需求日益增長，大腸桿菌因其易于遺傳操作、低成本、生長迅速成為生產(chǎn)重組蛋白的首-選微生物宿主。本文將綜述大腸桿菌中高通量重組蛋白表達的現(xiàn)狀和未來展望，探討從目的基因獲取到蛋白表達和純化的先-進技術，并討論如何克服重組蛋白表達過程中的挑戰(zhàn)。

高通量重組蛋白表達技術

高通量研究是一種能夠同時檢測數(shù)千個生物分子，使大規(guī)模重復成為可能的研究。20世紀90年代初，第-一臺DNA測序儀被開發(fā)出來，人類基因組計劃隨之開啟，高通量技術在DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物檢測的需求也急劇增加。自該技術提出以來，大腸桿菌中高通量重組蛋白表達和純化已經(jīng)得到了廣泛的應用。

1. 目的基因的制備

獲取目的基因是重組蛋白表達的第-一步。傳統(tǒng)的方法是從cDNA文庫中直接克隆基因，但這種方法存在局限性，如從庫中篩選基因較為費時以及難以添加融合標簽等。高通量PCR技術是目前獲取目的基因最-常用的技術，設計引物并調(diào)整好參數(shù)后，即可在PCR儀中自動完成目的基因的制備。 

2. 表達載體的高通量構建

研究人員開發(fā)了多種構建表達載體的克隆方法，包括基于限制性內(nèi)切酶的克隆、重組克隆和不依賴于連接反應的克隆等。這些方法各有優(yōu)勢和局限性，但在近年來都有顯著改進。例如，基于限制性內(nèi)切酶的克隆因其簡單、高效、通用和成本效益而備受關注。一個理想的大腸桿菌表達載體應具備選擇標記、復制起點、轉(zhuǎn)錄啟動子、5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和翻譯起始位點。此外，融合標簽的添加對于目的基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達同樣至關重要。

3. 大腸桿菌表達菌株的選擇和細胞培養(yǎng)

為保證蛋白質(zhì)表達成功及其表達質(zhì)量，應選擇合適的大腸桿菌菌株，如BL21及其衍生菌株是較常用的重組蛋白生產(chǎn)菌株。培養(yǎng)大腸桿菌比較簡單的方法是分批培養(yǎng)，但此方法對生長的控制比較有限。近年來，高通量培養(yǎng)技術使研究人員能夠在一系列發(fā)酵條件下處理大量樣品，大大加快了生產(chǎn)時間。

4. 高通量蛋白表達和純化

高通量平臺可以快速克隆基因、挑選菌落、分離質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)化細菌、表達和純化蛋白質(zhì)。這些平臺雖然成本高昂，但為復雜的分子生物學實驗操作提供了極大的便利。

結(jié)論與展望

大腸桿菌中的高通量重組蛋白表達技術極大的推進了重組蛋白的表達進程。盡管存在挑戰(zhàn)，但通過不斷優(yōu)化和創(chuàng)新，研究人員正在朝著更高效可靠的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)改進。未來的發(fā)展方向包括進一步優(yōu)化克隆方法、開發(fā)新的融合標簽、改進表達載體和菌株，以及利用高通量技術實現(xiàn)從DNA到大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)的快速轉(zhuǎn)變等。

參考文獻：

Jia B, Jeon CO. High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives. Open Biol. 2016;6(8):160196. doi:10.1098/rsob.160196