細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)
近年來，致力于活細(xì)胞成像（Live Cell Imaging *又被稱為活細(xì)胞成像、延時拍攝成像）的研究人員不斷增加。因為這種方式無需固定細(xì)胞，可觀察細(xì)胞原始結(jié)構(gòu)變化。但是，以活細(xì)胞為對象的觀察難度高，會耗費很長的觀察時間，經(jīng)常會有研究者因此失敗。
為此，我們特意面向備受活細(xì)胞成像失敗困擾及今后要開展相關(guān)實驗的人士，匯總了常見的3大失敗事例及其對策，現(xiàn)介紹如下。
活細(xì)胞成像的失敗事例1：細(xì)胞衰弱
活細(xì)胞成像的失敗事例2：焦點模糊
活細(xì)胞成像的失敗事例3：細(xì)胞逃離視野
使活細(xì)胞成像實驗效率大幅提高的方法
在活細(xì)胞成像期間或結(jié)束后查看細(xì)胞的情況，經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)細(xì)胞從中途開始衰弱、細(xì)胞死亡、細(xì)胞變?yōu)橐庀氩坏降臓顟B(tài)等現(xiàn)象。導(dǎo)致這些現(xiàn)象的原因可分為以下幾種。
熒光觀察時，激發(fā)光的波長越短或光照越強(qiáng)，對細(xì)胞造成的損傷也就越大。這就是所謂的“光毒性*1"，不僅會導(dǎo)致細(xì)胞因受損而衰弱、死亡，還有可能會造成出乎意料的影響。
對策
請盡可能使用靈敏度高的相機(jī)
請并用增益*2 、Binning*3 等設(shè)定，即使較弱的熒光也能感知
請盡量調(diào)弱激發(fā)光
進(jìn)行拍攝設(shè)定時也請盡量避免照射激發(fā)光
請盡可能減少要拍攝的張數(shù)
不進(jìn)行拍攝時請切斷激發(fā)光
*1：光毒性：通常指照射的光造成的損傷，但是在熒光觀察時，指細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧使周圍的細(xì)胞遭受損傷。
*2：增益：對相機(jī)接收的信號進(jìn)行放大。放大程度越高（調(diào)高增益），顯示的畫面越明亮。雖然像素數(shù)不會變，但是會產(chǎn)生噪點。
*3：Binning：虛擬地結(jié)合周圍的像素，放大單位像素接收的光信號的功能。噪點較調(diào)高增益時更少，但是像素數(shù)會減少。
多數(shù)細(xì)胞都喜歡與生物體內(nèi)相同的環(huán)境。以人類細(xì)胞為例，在培養(yǎng)室及培養(yǎng)用恒溫箱中，基本上都需要滿足溫度37℃、二氧化碳濃度5%、濕度95%以上的條件。如果沒有穩(wěn)定供給這一條件，細(xì)胞就會衰弱，很難獲得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。
對策
請使用可以穩(wěn)定提供適合環(huán)境（溫度、二氧化碳濃度、濕度）的培養(yǎng)室及恒溫箱
在室溫變化大的季節(jié)，請使用空調(diào)等保持室溫穩(wěn)定
請避免空調(diào)等的風(fēng)直接吹到樣品。
使用多孔培養(yǎng)板時，請使用水分不會蒸發(fā)的型號
有的細(xì)胞容易受容器上附著的菌、污染物的影響。此外，移液管等實驗用器械可能也會導(dǎo)致支原體污染*4、交叉培養(yǎng)污染 *5。
對策
實驗時，請確保使用的容器、移液管等周邊用品設(shè)備均為無菌狀態(tài)
請盡量避免攜帶細(xì)胞移動
*4：支原體污染：由支原體引起的感染。在細(xì)胞株被污染的眾多原因中，是極為普遍的現(xiàn)象之一。
*5：交叉培養(yǎng)污染：正在操作中的細(xì)胞混入其他細(xì)胞。多為器械原因混入。
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耗時許久的實驗終于結(jié)束，一看得到的數(shù)據(jù)，卻發(fā)現(xiàn)焦點從中途就模糊了。這種現(xiàn)象是較多的失敗事例之一。許多研究者都經(jīng)歷過這種失敗，但只要理解其中的原因，其實是可以主動避免的。
如果在接通裝置電源后馬上進(jìn)行拍攝設(shè)定，焦點在設(shè)定期間可能就會發(fā)生偏移。這是因為接通電源后的一段時間內(nèi)，容器內(nèi)的培養(yǎng)液會發(fā)生對流，細(xì)胞也會移動。觀察設(shè)備等也會因溫度變化而出現(xiàn)一定的膨脹現(xiàn)象，使焦點發(fā)生偏移。在觀察漂浮細(xì)胞、粘附細(xì)胞時，都需要注意拍攝設(shè)定中與拍攝中的溫度偏差。
對策
請在放置細(xì)胞前用空容器暖機(jī)運(yùn)行30分鐘，
暖機(jī)運(yùn)行后放置細(xì)胞，在設(shè)定焦點等之前還要等待30至60分鐘
*7：溫度漂移：溫度變化導(dǎo)致漂浮的細(xì)胞運(yùn)動的現(xiàn)象、因裝置自身的膨脹使對焦位置錯開的現(xiàn)象。
活著的細(xì)胞在分裂時尤其會朝上下方向（Z方向）運(yùn)動。因此，如果在分裂的瞬間用高倍率進(jìn)行單次自動對焦拍攝，焦點會發(fā)生偏移。
對策
請使用景深*8大的低倍鏡頭
如果是高倍率，請使用自動對焦功能或Z棧功能
在活細(xì)胞成像中采取上述預(yù)防措施，可切實防止焦點偏移。此時，為了盡量縮短照射激發(fā)光的時間，盡量縮小自動對焦及Z棧的設(shè)定范圍*9也是非常關(guān)鍵的。
*8：景深：表示對焦的范圍。一般NA越高景深越淺。
*9：Z棧的設(shè)定范圍：Z棧是對不同的Z位置數(shù)據(jù)進(jìn)行多張拍攝的功能。拍攝范圍越大移動步徑越小，可獲得的信息越多，但是細(xì)胞的損傷也相應(yīng)地增加，因此希望以盡可能少的張數(shù)進(jìn)行設(shè)定。
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實驗后觀看數(shù)據(jù)時，有時會發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已經(jīng)中途移到了視野范圍外。要是細(xì)胞在目標(biāo)現(xiàn)象尚未完成時發(fā)生了移動，就只能重做實驗。
實驗時間越長，細(xì)胞逃離視野范圍的可能性越高。只要細(xì)胞是活著的，就無法避免這一問題。相信大家都在各類論文中讀到過觀察細(xì)胞細(xì)節(jié)的數(shù)據(jù)。其中的絕大多數(shù)，都是通過高倍率反復(fù)進(jìn)行多次拍攝后獲得的結(jié)果，需要耗費大量的時間和精力。
要切實避免失敗，較好的方法就是一次性拍攝多點，或者是讓視野追隨移動的細(xì)胞進(jìn)行拍攝。
對策
請用倍率低的鏡頭拍攝大的視野
請一次拍攝多個部位
低倍率觀察時視野較大，細(xì)胞不易逃離視野，可切實捕捉細(xì)胞。但使用低倍率，卻無法觀察細(xì)胞的細(xì)節(jié)。曝光時間也會變長，如觀察對象在拍攝期間運(yùn)動，圖像也可能會發(fā)生抖動*10，故請注意。
*10：曝光時間和圖像抖動：調(diào)弱激發(fā)光，曝光時間自然變長。如果在打開快門期間細(xì)胞動了，圖像就會抖動。要防止這種現(xiàn)象，使用高靈敏度的相機(jī)是一種有效的辦法。
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一直以來，要獲得更好的研究成果，就必須重復(fù)進(jìn)行更多次的實驗，獲取更多的信息。但是活細(xì)胞成像實驗的單次耗時很長，多次重復(fù)會耗費大量的時間。特別理想的狀態(tài)，就是能夠在單次實驗中獲取盡可能多的信息。
基恩士的一體化熒光顯微成像系統(tǒng)“BZ-X800系列"，能夠解決活細(xì)胞成像“單次實驗可獲得的信息量"問題。可一次性獲取2倍、4倍、20倍等不同條件下最多999個點的數(shù)據(jù)。設(shè)定操作也很簡單，可縮短過去用于系統(tǒng)準(zhǔn)備及使用者培訓(xùn)的時間。
熒光顯微成像系統(tǒng) 產(chǎn)品目錄
有關(guān)新型一體化熒光顯微成像系統(tǒng)BZ-X800的詳情，請參閱產(chǎn)品目錄。
如需進(jìn)一步了解詳情
基恩士還準(zhǔn)備了活用事例集，請務(wù)必一看。
下面將為您介紹利用一體化熒光顯微成像系統(tǒng)“BZ-X800"的先進(jìn)研究事例
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