研究設計

使用算法和體內選擇來優(yōu)化AGT CDS和UTR序列。

通過檢測HEK293T細胞裂解液中丙酮酸的含量，確認轉染后蛋白是否具有功能，并通過免疫熒光確認AGT蛋白的細胞器定位。

在人類3D肝模型和AGT缺陷動物中分別評估hAGT mRNA的療效。包括在Agxt-/-小鼠和大鼠中的單次給藥、單次給藥聯(lián)合口服維生素B6、乙二醇誘導后的單次給藥以及在Agxt-/-大鼠中的多次給藥（每周一次，共3周）。

研究者在野生型小鼠、大鼠和食蟹猴中設計了多劑量給藥的毒理學研究，檢測了動物的攝食量、體重、體溫、心電圖和血壓、血漿生化、血液學檢查、血液凝固和免疫學指標。

研究結果

研究者對人類AGT蛋白在不同物種中的同源性進行了全面分析，發(fā)現其在人類、小鼠、大鼠和食蟹猴中具有高度同源性，這為后續(xù)的實驗研究提供了優(yōu)化基礎。為了優(yōu)化hAGT mRNA的穩(wěn)定性和密碼子使用，研究者應用了“LinearDesign"程序，通過計算機模擬和算法優(yōu)化，對mRNA序列進行了精心設計，確保其在體內的穩(wěn)定性和高效表達。隨后，研究者將優(yōu)化后的mRNA序列包裝在LPP中，以實現高效的體內遞送。在眾多優(yōu)化的mRNA序列中，2770 hAGT mRNA脫穎而出，它不僅表現出最高的密碼子適應指數（CAI）值，還具有適中的最小自由能（MFE）值，這使得它在后續(xù)的實驗中成為研究者的主要候選序列。

在體外轉染實驗中，2770 hAGT mRNA在HEK293T細胞中展現出高效的蛋白表達能力，且顯著高于其他候選序列。進一步地，研究者篩選了非翻譯區(qū)（UTR）組合，以增強mRNA在肝臟中的翻譯效率。經過一系列實驗驗證，研究者發(fā)現UTR1組合的hAGT mRNA在大鼠肝臟中能夠產生最高的蛋白表達水平。此外，研究者對LPP遞送系統(tǒng)進行了表征，結果顯示其粒徑均勻，約為87.2 nm， PDI為0.04，包封率超過90%，平均zeta電位為-10.36 mV，這些物理特性確保了LPP能夠在體內穩(wěn)定地攜帶并遞送mRNA。在穩(wěn)定性研究中，研究者發(fā)現hAGT mRNA/LPP在4℃和-20℃下儲存4周后，其PDI和粒徑仍能保持相對穩(wěn)定，但在25℃下則會出現顯著增加，這提示研究者在實際應用中需要嚴格控制儲存溫度。多次凍融循環(huán)后，粒徑、包封率和純度均無顯著變化，這表明研究者的制劑具有良好的凍融穩(wěn)定性，能夠滿足實際應用中的多次凍融需求。

通過免疫熒光染色技術，研究者觀察到轉染hAGT mRNA/LPP的HEK293T細胞中，AGT蛋白主要分布在過氧化物酶體中，與其正常的生理功能相符合。酶活性測定實驗進一步證實了這一觀察結果，隨著mRNA轉染含量的增加，細胞內丙酮酸濃度逐漸上升。這表明AGT蛋白在轉染后能夠正常發(fā)揮其酶活性，催化相應的生化反應，為后續(xù)的體內實驗提供了細胞水平的驗證。

研究者成功構建了人類PH1肝臟3D模型，這一模型能夠模擬體內肝臟的組織結構和功能，為研究PH1的病理機制和治療方法提供了理想的平臺。將構建好的3D模型轉染hAGT mRNA/LPP后，研究者發(fā)現hAGT mRNA在模型中具有較高的表達水平，這表明研究者的轉染方法在3D模型中同樣有效。更重要的是，草酸積累量在轉染后顯著減少，與正常肝臟3D模型的草酸含量接近，這一結果直接證明了hAGT mRNA/LPP在恢復肝臟正常代謝功能方面的潛在療效。通過免疫熒光染色，研究者還觀察到AGT蛋白在3D模型中的表達可持續(xù)5天，且細胞未出現明顯損傷，這為后續(xù)的長期治療研究提供了希望。

在野生型Balb/c小鼠中，研究者詳細研究了hAGT mRNA/LPP的藥代動力學特性。結果顯示，在小鼠肝臟和血液中，hAGT mRNA的表達在注射后6小時達到峰值，隨后逐漸下降，48小時后趨于低水平，這表明mRNA在體內的表達具有一定的時效性。在AgxtQ84-/-大鼠中，hAGT mRNA的表達趨勢與小鼠相似，且在1 mg/kg和2 mg/kg劑量下，6小時后的表達量分別為野生型大鼠的8倍和70倍，這一結果不僅驗證了研究者的遞送系統(tǒng)在不同物種中的有效性，還為后續(xù)的藥效學研究提供了合適的劑量范圍。Western blot和免疫組化結果進一步顯示，在大鼠肝臟中，hAGT蛋白在48小時內高表達，96小時后仍可檢測到，這表明研究者的mRNA替代療法能夠在體內持續(xù)產生具有功能的AGT蛋白。在食蟹猴中，hAGT mRNA在肝臟中的表達在第一次和第三次注射后的48小時達到高峰，144小時后仍可檢測到，這一結果提示研究者的療法在非人靈長類動物中也具有良好的表達效果，為未來的臨床試驗提供了重要的參考數據。

討論

本研究系統(tǒng)地評估了mRNA蛋白替代療法在兩種不同的PH1模型中的安全性和有效性。通過CDS和UTR序列優(yōu)化，研究者篩選出高表達的hAGT mRNA模板，并選擇LPP遞送系統(tǒng)以實現mRNA在肝臟中的持續(xù)表達。藥代動力學研究表明，AGT蛋白在144小時內持續(xù)表達，Agxt-/-小鼠、Agxt-/-大鼠以及PH1患者來源的類器官均證實了hAGT mRNA/LPP的治療效果。此外，研究者還發(fā)現hAGT mRNA/LPP在2 mg/kg劑量下僅產生適度的不良反應。

研究者觀察到未來臨床試驗應用的局限性。盡管研究者延長了AGT蛋白活性的持續(xù)時間，頻繁注射限制了其潛在應用。此外，PEG抗體的存在可能進一步阻礙更高劑量mRNA蛋白替代療法的改進。

結論

通過結合mRNA設計與LPP遞送系統(tǒng)，研究者成功延長了蛋白表達的持續(xù)時間，并在多種PH1疾病動物模型中降低了尿草酸水平。mRNA/LPP系統(tǒng)在嚙齒動物和靈長類動物中均表現出安全性和耐受性。研究者的臨床前實驗為mRNA蛋白替代療法在PH1患者中的治療潛力提供了有希望的證據。