BK-FL正置熒光顯微鏡是利用特定波長(zhǎng)的光照射被檢物體產(chǎn)生熒光進(jìn)行鏡檢的顯微光學(xué)觀測(cè)技術(shù)。近年來(lái)，由于免疫熒光在醫(yī)學(xué)研究、診斷領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)ISH、綠色熒光蛋白(GFP)技術(shù)分別在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的推廣，顯微照相、數(shù)字CCD成像技術(shù)的輔助驅(qū)動(dòng)，賦予這一傳統(tǒng)技術(shù)更新的應(yīng)用價(jià)值和生命力。
熒光現(xiàn)象有兩種：一次熒光現(xiàn)象，又稱“固有熒光”或“自發(fā)熒光”，是指經(jīng)照射后，就能發(fā)出熒光的物質(zhì)，此類物質(zhì)的化學(xué)特征是發(fā)光分子具有共軛雙鍵，π電子活動(dòng)性大。二次熒光現(xiàn)象，又稱“繼發(fā)熒光”，物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱的熒光，這樣就需先用熒光色素標(biāo)記處理，將熒光色素標(biāo)記結(jié)合插入到不發(fā)光的活性分子中去，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。熒光色素應(yīng)具備的基本條件是能與不發(fā)光分子的某個(gè)區(qū)域有特異性的牢固結(jié)合，同時(shí)不會(huì)影響被結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)和特性，光量子效率應(yīng)≥013。
BK-FL正置熒光顯微鏡標(biāo)本制作特點(diǎn)和觀察要求
(1)載玻片：載玻片厚度應(yīng)在0.8―1.2mm之間，玻片太厚吸收光多，激發(fā)光難以在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。
(2)蓋玻片：蓋玻片厚度應(yīng)約0.17mm，光潔。為加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這種特制蓋玻片的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)，它可以使熒光順利通過(guò)而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光可激發(fā)標(biāo)本中的熒光。
(3)標(biāo)本：組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，一般以5～20pm為宜，切片太厚可使激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察的標(biāo)本上部不能被激發(fā)。切片折疊或雜質(zhì)過(guò)多均可影響熒光的觀察。
(4)封片劑：封片劑必須無(wú)自發(fā)熒光、五色透明。加上抗淬滅劑后再用指甲油將蓋玻片四周封固，既保持蓋玻片不滑動(dòng)，又能防止抗淬滅劑蒸發(fā)。在沒(méi)有抗淬滅劑的情況下，也可使用含30%甘油的PBS，還可用甘油與0.5mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.0～9.5)等量混合液作封片劑。
(5)鏡頭的清潔：在油鏡使用完畢后，需用擦鏡紙沾上無(wú)水乙醇或3：7的醇醚混合液輕輕擦拭。
(6)及時(shí)觀察：標(biāo)本染色后應(yīng)及時(shí)觀察，因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)熒光會(huì)逐漸減弱。若標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間。
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