蛋白印跡儀，也稱(chēng)為Western Blot儀器，其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度，可以獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。
核心步驟：
蛋白質(zhì)電泳分離：利用電泳技術(shù)將細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)分離。
轉(zhuǎn)膜：將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，如硝酸纖維素薄膜(NC膜)或PVDF膜。
封閉：使用封閉液封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。
抗體孵育：將特異性抗體與膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育，使抗體與目的蛋白質(zhì)結(jié)合。
顯影：通過(guò)底物顯色或熒光成像等手段，檢測(cè)與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)。
操作使用需要注意哪些事項(xiàng)？
1、抗體選擇：一抗的選擇是影響免疫印跡成敗的主要因素。多克隆抗體結(jié)合抗原能力較強(qiáng)、靈敏度高，但易產(chǎn)生非特異性的背景；單克隆抗體識(shí)別抗原特異性較好，但可能不識(shí)別在樣品制備時(shí)因變性而失去了空間構(gòu)型的抗原表位。因此，在選擇抗體時(shí)需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行權(quán)衡。
2、膜的選擇：一般情況使用0.45μm的NC膜，0.1~0.2μm的小孔徑膜只適合于分子量小于20kD的蛋白質(zhì)。PVDF尼龍膜較NC膜柔軟、結(jié)實(shí)、靈敏度高，易于操作且蛋白質(zhì)結(jié)合能力強(qiáng)，但背景也高，需要加強(qiáng)封閉。
3、操作細(xì)節(jié)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意操作細(xì)節(jié)，如避免濾紙/凝膠/轉(zhuǎn)印膜/濾紙夾層組合中存在氣泡，以提高轉(zhuǎn)膜效率；確保上下兩層濾紙不能過(guò)大，避免導(dǎo)致直接接觸而引起短路等。
蛋白印跡儀是一種功能強(qiáng)大且應(yīng)用廣泛的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究設(shè)備。通過(guò)正確使用和維護(hù)保養(yǎng)，可以為科研人員提供準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和可靠的數(shù)據(jù)支持。
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