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【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：豬輪狀病毒（PRV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：Porcine Rotavirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】

豬輪狀病毒病是由豬輪狀病毒感染引起的以急性腹瀉為特征的急性腸道傳染病，臨床上以水樣腹瀉，嘔吐，嗜睡脫水，厭食，迅速消瘦為主要特點，目前尚無特-效-藥物進(jìn)行針對性治療，疫苗免疫效果也參差不齊，   給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬輪狀病毒 A 型是引起仔豬（包括斷奶前后的）腹瀉最常見的亞型，在由豬輪狀病毒引起商品化豬群的所有腹瀉病中占 90%上。

本試劑盒適用于檢測豬科研樣品（豬小腸和新鮮糞便）或細(xì)胞培養(yǎng)物中豬輪狀病毒的 RNA，適用于豬輪狀病毒感染的輔助檢測。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計一對豬輪狀病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對豬輪狀病毒的 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于科研實驗中對可疑感染者的病原學(xué)檢測。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

PRV 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

PRV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

采集腹瀉急性期的小腸（5.0cm~10.0cm）或新鮮糞便（5.0g~10.0g），放到密封袋中，置于帶有冰袋的保   存箱中，送至實驗室[1]。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

小腸樣品：取 5.0cm~10.0cm 小腸組織，用剪刀剪碎，加入 10mL PBS，用適宜規(guī)格的組織研磨器或研缽研磨后轉(zhuǎn)移到適宜玻璃瓶中，每毫升樣品加入 RNA 酶抑制劑 RRI（40U/μL）500μL，-20℃反復(fù)凍融 3 次后，搖勻，取 1.0mL 到 1.5mL 離心管中，經(jīng) 12000 r/min 離心 5min，取 500μL 上清備用。

糞便樣品：取 0.5g~1.0g 新鮮糞便，加入到含 5.0mL~10.0mL 樣品處理液（配方參考 GB/T 34756-2017 豬輪狀病毒病病毒 RT-PCR 檢測方法的規(guī)范性附錄 A.2）的玻璃瓶中，每毫升樣品加入 RNA 酶抑制劑 RRI（40 U/μL）500μL，-20℃反復(fù)凍融 3 次后，搖勻，取 1.0mL 到 1.5 mL 離心管中，經(jīng) 12000 r/min 離心 5min，取500μL 上清液備用。

細(xì)胞培養(yǎng)物樣本：取細(xì)胞培養(yǎng)物，每毫升樣品加入 RNA 酶抑制劑 RRI（40 U/μL）500μL，反復(fù)凍融 3 次， 經(jīng) 2000 r/min 離心 10min，取 1mL 上清備用[ 1]。

1.2核酸提取

推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取，   請按照試劑說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑PRV 反應(yīng)液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle50℃10min否

21 cycle95℃2min否

345cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 國家市場監(jiān)督管理總局. GB/T 34756-2017 豬輪狀病毒病病毒 RT-PCR 檢測方法[S].