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【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：肺炎鏈球菌（SP）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：Streptococcus pneumoniae Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae, SP）可定植與呼吸道粘膜，當呼吸系統(tǒng)防御功能及肺部正常清除功能受損時，可引起呼吸系統(tǒng)疾病。各個年齡段人群都可能受感染，2 歲以下的幼兒最容易罹患。臨床對獲得肺炎患者診斷的金標準是細菌培養(yǎng)鑒定，但耗時長，繁瑣。熒光 PCR 技術(shù)為肺炎鏈球菌提供了快速而敏感的診斷方法，解決了傳統(tǒng)方法的不足。

本試劑盒適用于檢測患者痰、咽拭子等樣本中的肺炎鏈球菌，用于肺炎鏈球菌感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計一對肺炎鏈球菌特異性引物，結(jié)合一條特異性探針， 用熒光 PCR 技術(shù)對肺炎鏈球菌的 DNA 進行體外擴增檢測，用于科研實驗中對可疑感染病料的病原學檢測。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

SP 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

SP 陽性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

采集病人痰液或咽拭子標本，咽拭子應(yīng)使用專用采樣拭子，適度拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及   舌部；迅速將拭子放入標本采集管中，旋緊管蓋并密封，以防干燥。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

取痰或咽拭子拭子 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明書進    行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑SP 反應(yīng)液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX

參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值，且無特異性擴增曲線；

可疑：樣本檢測結(jié)果 40＜Ct 值≤45，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 40<Ct 值≤45，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性。

5.3質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]顏善活, 孫雷, 符可鵬, 等. 實時熒光定量 PCR 快速診斷肺炎鏈球菌[J]. 檢驗醫(yī)學,2013. [2]吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局. DB22/T 2567-2016 肺炎鏈球菌核酸檢測 PCR 法[S].