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高效檢測激酶活性:Revvity HTRF® KinEASE試劑盒

2025-5-7  閱讀(139)

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在藥物研發(fā)和生命科學(xué)研究中,蛋白激酶作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心調(diào)控元件,在多種病理生理過程中扮演關(guān)鍵角色。據(jù)統(tǒng)計,人類基因組編碼的518種蛋白激酶中,約有30%與腫瘤、自身免疫病和代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前,全球激酶抑制劑市場規(guī)模已突破750億美元,并保持10%以上的年增長率,成為腫瘤和自身免疫疾病治療的核心領(lǐng)域。

激酶異?;罨牟±頇C制

01信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)

正常生理狀態(tài)下,激酶通過精確的磷酸化調(diào)控維持細(xì)胞功能平衡。而在疾病狀態(tài)下,激酶活性異常(過度活化或抑制不足)會導(dǎo)致下游信號通路紊亂,驅(qū)動細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)或代謝異常等病理過程。

02多通路交叉調(diào)控

激酶網(wǎng)絡(luò)具有高度的復(fù)雜性和冗余性,常形成正反饋循環(huán)和代償機制。例如:

• MAPK通路異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展

• JAK-STAT通路過度活化與自身免疫病

• PI3K-AKT-mTOR通路失調(diào)與代謝性疾病

典型激酶相關(guān)疾病及治療靶點



Revvity激酶研究解決方案

傳統(tǒng)激酶活性檢測方法(放射性檢測、ELISA等)存在操作繁瑣、通量受限等問題,而ADP-Glo方法需要自行尋找活性底物,且是間接檢測酶活。Revvity基于HTRF/LANCE均相檢測平臺,提供激酶研究解決方案,可為研究者提供高效、快速的激酶抑制劑篩選方法。

01Kinase活性檢測試劑盒

適用于功能性激酶抑制的篩選,通過直接檢測底物磷酸化水平的變化,定量分析化合物對激酶催化活性的抑制能力。

02Kinase結(jié)合檢測試劑盒

適用于激酶結(jié)合劑的篩選,通過競爭性結(jié)合實驗檢測化合物與激酶活性位點或變構(gòu)位點的親和力。

Kinase檢測技術(shù)具有以下優(yōu)勢

• 高靈敏度:可檢測pM級激酶活性變化

• 生理相關(guān)性:保持天然構(gòu)象的激酶-底物相互作用

• 高通量:適合大規(guī)?;衔锖Y選,檢測僅需2小時

• 高兼容性:試劑盒配備的通用型底物兼容200+激酶

HTRF技術(shù)原理與應(yīng)用實例

KinEASE活性檢測試劑盒

檢測原理

KinEASE激酶活性檢測試劑盒基于均相時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(HTRF)技術(shù),采用通用型生物素化絲氨酸/蘇氨酸激酶(STK)或者酪氨酸(TK)底物與鏈霉親和素-XL665(SA-XL665)受體結(jié)合,當(dāng)激酶催化底物磷酸化后,供體銪穴狀化合物(Eu3?-cryptate)標(biāo)記的磷酸化特異性抗體可識別并結(jié)合磷酸化位點,形成"供體-底物-受體"三元復(fù)合物;在320/340nm激發(fā)光作用下,供體產(chǎn)生的620nm發(fā)射光通過能量轉(zhuǎn)移激發(fā)受體發(fā)出665nm特征信號,該信號由酶標(biāo)儀檢測并定量分析激酶活性。




圖1. HTRF KinEASE活性檢測原理


操作流程

步驟1:反應(yīng)啟動

將待測化合物(或?qū)φ站彌_液)與激酶、底物混合,加入ATP啟動磷酸化反應(yīng)。


步驟2:檢測體系構(gòu)建

反應(yīng)孵育適當(dāng)時間后,加入銪(Eu)標(biāo)記的磷酸化抗體及SA-XL665受體,形成檢測復(fù)合物。


步驟3:信號檢測

繼續(xù)孵育1小時后,使用酶標(biāo)儀讀取信號(激發(fā)波長320/340 nm,檢測發(fā)射波長620 nm和665 nm)。






圖2. HTRF KinEASE 活性檢測步驟


驗證數(shù)據(jù)

HTRF KinEASE試劑盒已完成200余種絲氨酸/蘇氨酸激酶及酪氨酸激酶的活性檢測驗證。同時,我們也提供LANCE® Ultra激酶檢測平臺作為選擇



酶濃度梯度滴定曲線與時間動力學(xué)特征



廣譜抑制劑星形孢菌素(Staurosporine)劑量依賴性抑制效應(yīng)



激酶結(jié)合檢測試劑盒

檢測原理

Revvity KinEASE結(jié)合檢測試劑盒采用HTRF競爭法檢測原理,通過Eu3?-cryptate標(biāo)記的GST/6His/生物素抗體捕獲相應(yīng)標(biāo)記的激酶,當(dāng)激酶與熒光標(biāo)記的ATP競爭性抑制劑示蹤劑(Staurosporine、Dasatinib或Sunitinib)結(jié)合時,HTRF信號比(665nm/620nm)隨示蹤劑結(jié)合增加而升高;待測化合物通過競爭性結(jié)合激酶ATP位點取代熒光示蹤劑,導(dǎo)致FRET信號減弱,從而實現(xiàn)對激酶抑制劑的快速篩選和親和力評估。



圖3. HTRF Kinase Binding檢測原理

操作流程

步驟1:復(fù)合物形成

將Eu3?-cryptate標(biāo)記的抗體(抗GST/6His/生物素)與標(biāo)簽激酶孵育,使其特異性結(jié)合;同時加入熒光示蹤劑(Staurosporine/Dasatinib/Sunitinib-XL665)和待測化合物,兩者競爭性結(jié)合激酶的結(jié)合位點

步驟2:信號檢測

繼續(xù)孵育1小時后,使用酶標(biāo)儀讀取信號(激發(fā)波長320/340 nm,檢測發(fā)射波長620 nm和665 nm)。



圖4. HTRF Kinase Binding檢測步驟

驗證數(shù)據(jù)

d2熒光受體標(biāo)記的紅色示蹤劑示蹤劑滴定曲線



幾種激酶結(jié)合劑的劑量依賴性抑制曲線




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