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極性改性反相色譜柱的基本原理和日常使用注意事項(xiàng)
極性改性反相色譜柱是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣，RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面被非極性基團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疏水性。因此，需用極性有機(jī)溶劑或其水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。
溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。當(dāng)固定相一定時(shí)，可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)。RPC主要應(yīng)用于相對(duì)分子質(zhì)量低于5000，特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。由于反相介質(zhì)表面為強(qiáng)烈疏水性，并且流動(dòng)相為低極性的有機(jī)溶劑，生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活，所以，以回收生物活性蛋白質(zhì)為目的時(shí)，應(yīng)注意選用適宜的反相介質(zhì)。
反相介質(zhì)的商品種類繁多，其中代表性的是以硅膠為載體，通過表面鍵合非極性分子層制備。通過控制反應(yīng)時(shí)間和溫度，可獲得性能穩(wěn)定的反相介質(zhì)。在硅膠基質(zhì)的反相填料中，以鍵合有C18、C8、C2的球形多孔填料較為常見，用途較廣。
RPC固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團(tuán)，基于樣品中的不同組分和疏水基團(tuán)之間疏水作用的不同而分離。在生物大分子分離中，多采用離子強(qiáng)度較低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。
極性改性反相色譜柱的日常使用注意事項(xiàng)：
1、如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中。
2、氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。
3、若流動(dòng)相是緩沖鹽并且鹽的濃度比較高分析完畢樣品不要停泵，要立即沖洗色譜柱或者低流速平衡，以免色譜柱前段柱篩板堵塞。
4、使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度）。
5、避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化。
6、流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理。