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5-羥色胺ELISA Kit使用說明書

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深圳市科潤達(dá)生物工程有限公司
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5-羥色胺ELISA Kit使用說明書

（德國IBL:RE59121）

1、 應(yīng)用范圍

此試劑盒可用于人血清、血漿、血小板和尿液中五羥色胺的體外定量檢測(cè)。進(jìn)一步的研究表明：此試劑盒還可用于組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清液的研究。

2、前言說明

五羥色胺是色氨酸代謝的中間產(chǎn)物，它主要存在于腸嗜鉻細(xì)胞、血清素激活的神經(jīng)元和血小板中，它已被確定為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)遞質(zhì)。循環(huán)血液中的五羥色胺幾乎都集中于血小板內(nèi)。循環(huán)五羥色胺濃度的變化可反映出人體的一些病理變化，這些病理變化包括：慢性肌緊張性頭痛、精神分裂癥、高血壓、舞蹈癥、杜氏肌肉萎縮癥和早期急性闌尾炎。血清五羥色胺的檢測(cè)對(duì)類癌綜合征的檢測(cè)具有重要臨床意義。人們預(yù)計(jì)：在不久的將來，人們對(duì)血小板內(nèi)五羥色胺的研究興趣（包括五羥胺的吸收及釋放動(dòng)力學(xué)研究）應(yīng)該會(huì)不斷增長。

3、實(shí)驗(yàn)原理

樣品準(zhǔn)備（將五羥色胺轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>N-乙酰五羥色胺）是樣品的稀釋的一部分，將每一份樣品分別于?；噭┮黄饻赜涂梢缘玫锦；奈辶u色胺。此實(shí)驗(yàn)采用的是競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的原理，生物素標(biāo)記的和非生物素標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到一定數(shù)量的抗體結(jié)合位點(diǎn)上。zui后，結(jié)合到抗體上的生物素標(biāo)記抗原的量于樣品中被分析物的濃度成反比。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到平衡后，洗板除去未結(jié)合的生物素標(biāo)記抗原，用抗生物素堿性磷酸酶做標(biāo)記、對(duì)硝基苯磷酸做底物來檢測(cè)結(jié)合到抗體上的生物素標(biāo)記抗原的量。用已知標(biāo)準(zhǔn)品做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，將未知樣品的酶活性在標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行定標(biāo)就可以得到未知樣品中五羥色胺的濃度。

4、貯存與穩(wěn)定性

試劑盒和運(yùn)輸環(huán)境和儲(chǔ)存環(huán)境溫度為2-8℃，避免熱源或太陽直射。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定性及試劑的準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。打開了的試劑盒在有效期內(nèi)穩(wěn)定，前提是要將試劑盒用袋子密封并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下。

5、樣品的采集與儲(chǔ)存

注意	有些食物會(huì)含有一定量的五羥色胺，另外，有些藥物也會(huì)刺激五羥色胺的釋放，從而導(dǎo)致五羥色胺的濃度升高。病人應(yīng)當(dāng)禁食富含五羥色胺的食物，如：阿司匹林、促腎上腺皮質(zhì)激素、MAO抑制劑、phenazetin、兒茶酚氨、利血平和煙堿。

血清

注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項(xiàng)。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測(cè)時(shí)都應(yīng)保持血液樣品的化學(xué)整體性。不要使用明顯溶血、黃疸血和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁，則在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)當(dāng)離心以除去所有的微粒物質(zhì)。
貯存	18-25℃	2-8℃	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。
穩(wěn)定性	2小時(shí)	6小時(shí)	3個(gè)月	避免熱源或太陽直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h內(nèi)的所有尿液，之后將其加入到10-15ml 6N的HCl防腐劑中。確定用于結(jié)果結(jié)算的總體積。使用前請(qǐng)將所有樣品混合并離心。
貯存	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復(fù)凍融。
穩(wěn)定性	6個(gè)月

血漿、血小板

98%以上的循環(huán)五羥色胺都位于血小板內(nèi)，在血液凝集時(shí)就可以釋放出來。用靜脈穿刺的方法將全血收集到含EDTA或檸檬酸的塑料試管中（如10mlMonovette NC試管中加入1ml檸檬酸溶液）。室溫下，將全血樣品以200×g的速率離心10分鐘得到富含血小板的血漿（PRP）。將PRP-上清轉(zhuǎn)移到另一試管中。為了獲得血小板乳糜微粒，我們將200ulPRP（350000～500000個(gè)血小板/ul）加入到800ul生理鹽水中，之后4℃下以4500×g的速率離心10分鐘（或4℃下10000×g的速率離心2分鐘）。離心后棄取上清。在血小板乳糜微粒中加入200ul雙蒸水，之后樣品就可以在-20℃以下的環(huán)境下凍存數(shù)周了。將凍融的樣品在室溫下以1000×g的速率離心2分鐘。整個(gè)實(shí)驗(yàn)需要使用20ul上清液（見?；?/span> 如果您想測(cè)無血小板血漿（PFP）中五羥色胺的濃度，我們可以將PRP在4℃以4500×g的速率離心10分鐘（或4℃下10000×g的速率離心2分鐘）就可以獲得無血小板血漿（PFP）。游離五羥色胺的ELISA實(shí)驗(yàn)要使用50ul上清液（見?；?。注意：PRP中五羥色胺的直接檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明：大約10%的PRP樣品可以檢測(cè)到不可預(yù)知的高濃度五羥色胺（結(jié)果用液相層析和流氏細(xì)胞術(shù)獲得）。為了避免這種差異性，我們建議您即檢測(cè)血小板中五羥色胺，也檢測(cè)無血小板血漿中的五羥色胺。
	無血小板血漿	血小板微粒（從血漿中分離得到）		避免熱源或太陽直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。
儲(chǔ)存	≤-20℃	≤-20℃	≤-80℃
穩(wěn)定性	2周	4周	1年

組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清

使用組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清作樣品，一般無特殊注意事項(xiàng)

注意：細(xì)胞培養(yǎng)基可能含有一定量的五羥色胺！

儲(chǔ)存

≤-20℃

避免熱源或太陽直射，避免反復(fù)凍融。

穩(wěn)定性

6個(gè)月

6、試劑盒成分

注意	試劑盒有足夠做96份單孔檢測(cè)或48份雙孔檢測(cè)所需的試劑成分。

數(shù)量	標(biāo)記	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。
1×5ml	ANTISERUM	組胺抗血清，藍(lán)色，即用，內(nèi)含：兔抗血清、Tris緩沖液和0.01%的NaN₃。
1×5ml	BIOTIN	五羥色胺生物素，黃色，即用，內(nèi)含0.1%的NaN₃。
1×0.2ml	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物，10倍濃縮，內(nèi)含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素抗體、Tris緩沖液、HCl和0.01%的NaN₃。
1×7×0.5ml	CAL A-G	標(biāo)準(zhǔn)品A-G，0;0.08;0.24;0.73;2.2;6.6;19.8ng/ml,0;0.45;1.4; 4.1;12.5;37.4;112.3nmol/l,即用，內(nèi)含?；奈辶u色胺、磷酸鹽緩沖液和0.1%的NaN₃。
1×2×0.5ml	CONTROL 1+2 LYO	質(zhì)控品1+2，凍干，內(nèi)含人血清和0.02%的NaN₃。具體濃度及可允許范圍請(qǐng)見試劑瓶標(biāo)簽。
1×3ml	ACYLREAG	?；噭?/span> 內(nèi)含乙酸酐和丙酮，即用
1×50ml	ASSAYBUF CONC	檢測(cè)緩沖液，10倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、BSA和1%的NaN³。
1×50ml	WASHBUF CONC	洗滌液，20倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、吐溫和0.1%的硫柳汞。
1×9×	PNPP SUBS	PNPP底物片，密封于鋁鉑金屬袋內(nèi)，內(nèi)含對(duì)硝基苯酚磷酸鹽。
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液，即用，內(nèi)含二乙醇胺、水和0.05%的NaN₃。
1×15ml	PNPP STOP	PNPP終止液，即用，內(nèi)含1M的NaOH和0.25M的EDTA。
3×	FOIL	粘性金屬板

7、實(shí)驗(yàn)所需器材但試劑盒不提供

1）移液器，體積：20;25;50;100;1000ul

2）玻璃試管（12×75mm）

3）試管架

4）振蕩器（500rpm）

5）旋渦混合器

6）水浴箱，37℃

7）帶儲(chǔ)器的8道移液器

8）洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)洗板機(jī)

9）離心機(jī)：≥1500×g

10）可在405nm處讀數(shù)的酶標(biāo)儀（參考波長：600-650nm）

11）雙蒸水或去離子水

12）吸水紙、取樣吸頭和計(jì)時(shí)器

8、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備說明

供手動(dòng)和自動(dòng)操作參考用

注意

用于96孔檢測(cè)的試劑成分可分成3次用。下述體積是使用4條（32孔）時(shí)所需要的體積。如果客戶想將標(biāo)準(zhǔn)品從7支減為6支的話，我們可以省掉標(biāo)準(zhǔn)品G。則檢測(cè)范圍相應(yīng)的減少到155ug/l（血漿）或706ug/l（血清，尿液，組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清）。

血清、尿液、組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品可以選擇簡(jiǎn)短操作步驟進(jìn)行，只需溫育3.5個(gè)小時(shí)（但血漿樣品不能采用簡(jiǎn)短操作步驟進(jìn)行），以上樣品也可以選擇可選操作步驟進(jìn)行檢測(cè)（將樣品溫育一整夜），血漿樣品必須按照溫育一整夜進(jìn)行檢測(cè)。

8.1凍干或濃縮成分的準(zhǔn)備

稀釋/溶解	成分	加入	稀釋劑	比例	備注	儲(chǔ)存	穩(wěn)定性
15ml	檢測(cè)緩沖液	150ml	雙蒸水	1：10	出現(xiàn)黃褐色并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果	2-8℃	2周
15ml	洗滌液	300ml	雙蒸水	1：20		2-8℃	4周
	質(zhì)控品	0.5ml	雙蒸水		靜置15min,混合時(shí)無泡沫	≤-20℃	有效期內(nèi)穩(wěn)定
60ul	酶聯(lián)物	6ml	稀釋的檢測(cè)緩沖液	1:101	臨時(shí)配置,只能使用一次	18-25℃	2小時(shí)
3	PNPP底物片	8ml	PNPP底物緩沖液		臨時(shí)配置，只能使用一次	18-25℃	5小時(shí)

8.2樣品的稀釋

樣品五羥色胺濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用檢測(cè)緩沖液進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。

8.3樣品和質(zhì)控品的?；?/span>

樣品A：血清，尿液，血小板提取物，組織勻漿和質(zhì)控品

樣品B：無血小板血漿

注意	請(qǐng)不要?；瘶?biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)?；?。樣品準(zhǔn)備可使血清、尿液、血小板乳糜微粒、組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清被稀釋107倍，而血漿樣品則被稀釋23.5倍。結(jié)果計(jì)算時(shí)必須將此稀釋因子考慮進(jìn)去。

8.3.1樣品A：血清、尿液、血小板提取物、組織勻漿和質(zhì)控品

1	將質(zhì)控品和樣品A分別20ul加入到玻璃試管中。
2	在每一試管中加入100ul稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合。
3	在每一試管中加入25ul?；噭?/span>1（3%），加入后立即旋渦混合。
4	將試管蓋好，將試管放到37℃水浴箱內(nèi)溫育15分鐘。
5	在每一試管中加入2ml已稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合
6	1500×g下離心10分鐘
注意	準(zhǔn)備好的樣品必須立即檢測(cè)。其上清可在18-25℃下穩(wěn)定存放1小時(shí)。

8.3.2樣品B：無血小板血漿

1	將50ul樣品B加入到玻璃試管中。
2	在每一試管中加入100ul稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合。
3	在每一試管中加入25ul?；噭?，加入后立即旋渦混合。
4	將試管蓋好，將試管放到37℃水浴箱內(nèi)溫育15分鐘。
5	在每一試管中加入1ml已稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合
6	1500×g下離心10分鐘
注意	準(zhǔn)備好的樣品必須立即檢測(cè)。其上清可在18-25℃下穩(wěn)定存放1小時(shí)。

9、實(shí)驗(yàn)步驟

9.1簡(jiǎn)短操作步驟（僅供樣品A使用，不能應(yīng)用于血漿）

1	將標(biāo)準(zhǔn)品、?；玫馁\|(zhì)控品和酰化好的樣品各50ul加入到相應(yīng)的微孔中。
2	在每一微孔中加入50ul五羥色胺生物素。
3	在每一微孔中加入50ul五羥色胺抗血清。
4	蓋板，室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育90min。
5	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干以除去殘余液體。
6	在每一微孔中加入150ul臨時(shí)準(zhǔn)備好的酶聯(lián)物。
7	蓋板，室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育60min。
8	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干以除去殘余液體。
9	如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時(shí)，每孔間的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同。使用主動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。
10	在每一微孔中加入200ul臨時(shí)配置好的PNPP底物液。
11	室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育60min。
12	在每一微孔中加入50ul PNPP終止液以終止底物反應(yīng)，輕輕振板以使溶液混合均勻。
13	加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。

9.2可選操作步驟（溫育一整夜，樣品A和樣品B均適用）

9.2.1*天

1	將標(biāo)準(zhǔn)品、酰化好的質(zhì)控品和樣品分別50ul加入到相應(yīng)的微孔中。
2	在每一微孔中加入50ul五羥色胺生物素。
3	在每一微孔中加入50ul五羥色胺抗血清。
4	蓋板，輕輕振板，2-8℃下溫育16-20小時(shí)（一整夜）。

9.2.2第二天

1	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干以除去參與液體。
2	在每一微孔中加入150ul臨時(shí)配置好的酶聯(lián)物。
3	蓋板，室溫振蕩器上（500rpm）溫育60分鐘。
4	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干以除去殘余液體。
5	如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時(shí)，每孔間的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同。使用主動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。
6	在每一微孔中加入200ul臨時(shí)配置好的PNPP底物液。
7	室溫振蕩器上（500rpm）溫育30分鐘。
8	在每一微孔中加入50ul PNPP終止液，振板以混合孔內(nèi)成分。
9	加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。（參考波長：600-650nm）

10、結(jié)果計(jì)算

將所有標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品的OD值減去空白孔的OD值。在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值（Y軸，線性）對(duì)其濃度（X軸，對(duì)數(shù)）繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用自動(dòng)計(jì)算的方法繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Cubic spline、4參數(shù)或雙對(duì)數(shù)可以得到較好的曲線圖。在計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)當(dāng)應(yīng)用到每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)值（兩個(gè)數(shù)值中，明顯逸出的數(shù)值應(yīng)當(dāng)被忽略掉，采用更加合理的一個(gè)數(shù)值用）。樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上定量得到。

由于樣品被稀釋了，所以zui終樣品結(jié)果必須乘以相應(yīng)的稀釋因子，單位為ng/ml。

血清、尿液、血小板、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、質(zhì)控品： ×107

無血小板血漿： ×23.5

進(jìn)行了進(jìn)一步稀釋的樣品結(jié)果應(yīng)當(dāng)乘以相應(yīng)的稀釋因子。

實(shí)驗(yàn)必須滿足如下標(biāo)準(zhǔn)才符合要求：

50%OD/Odmax（ED50）：0.60-1.00ng/ml（平均0.8ng/ml）

△OD標(biāo)準(zhǔn)品A-標(biāo)準(zhǔn)品G≥0.80OD

轉(zhuǎn)換系數(shù)：

五羥色胺（ng/ml）×5.67=nmol/l

如果樣品中五羥色胺濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品，則此樣品必須按照實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備說明進(jìn)行稀釋并重新檢測(cè)。

11、期望值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能當(dāng)作任何治療結(jié)果的*原因，疾病的判斷還應(yīng)當(dāng)與其它臨床觀察和診斷檢測(cè)相結(jié)合。以下結(jié)果為正常人群的正常值（97.5%）：

樣品

數(shù)量

單位

平均值

建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室讀確定自己的正常值范圍

范圍

血清

ng/ml

88.6

30-200

無血小板血漿

ng/ml

3.7

1.8-7.5

血小板

ng/10⁹血小板

490

217-861

24小時(shí)尿液

μg/d

83.1

≤200

本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。

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