基孔肯雅熱IgM ELISA試劑盒說明書
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【預(yù)期用途】
基孔肯雅IgM抗體ELISA檢測試劑盒主要用于定性檢測人血清和血漿中抗基孔肯雅病毒的IgM抗體。
【實驗原理】
此試劑盒基于ELISA技術(shù)。包被板中包被了抗人IgM抗體，如果人血清或血漿中含有IgM時，則會與其特異性結(jié)合，洗板將未結(jié)合的物質(zhì)洗去， 然后加入基孔肯雅抗原溶液，洗板洗去未結(jié)合的物質(zhì)，然后加入鏈霉親和素和基孔肯雅抗體酶聯(lián)物。洗板后，加入TMB底物液，顏色變成藍色，加入終止液終止反 應(yīng)，顏色由藍色轉(zhuǎn)為黃色，zui后用酶標(biāo)儀在450nm處讀數(shù)。
【試劑組成】
包被板：12×8可拆卸，包被了抗人IgM抗體，密封在可重封鋁箔袋中
基孔肯雅溶液1：1瓶包含6mL的基孔肯雅抗原溶液，即用，白蓋
基孔肯雅溶液2：1瓶包含6mL的生物素化的基孔肯雅抗體，即用，藍色，白蓋
基孔肯雅IgM陽性質(zhì)控：1瓶，1.5mL，黃色，即用，紅蓋
基孔肯雅IgM臨界質(zhì)控：1瓶， 2mL，黃色，即用，綠蓋
基孔肯雅IgM陰性質(zhì)控：1瓶，1.5mL，黃色，即用，藍蓋
樣本稀釋液： 1瓶包含100mL的即用緩沖液，用于稀釋樣本，pH7.2±0.2，黃色，白蓋
洗滌液：1瓶，包含50mL 20倍濃縮的緩沖液，（pH7.2±0.2）用于洗板，白蓋
鏈霉親和素結(jié)合液：1瓶包含6mL過氧化物酶結(jié)合的鏈霉親和素，即用，紅色，黑蓋
TMB底物液：1瓶包含15mL TMB，即用，黃蓋
終止液：1瓶包含15mL，即用，內(nèi)含硫酸，0.2mol/l，紅蓋
【需要的設(shè)備和材料】
固定板
封板片
酶標(biāo)儀（450/620nm）
37℃孵箱
洗瓶或自動洗板機
10~1000μL的移液器
漩渦混勻器
蒸餾水或去離子水
一次性試管
計時器
【儲存和穩(wěn)定性】
試劑在有效期內(nèi)，儲存于2-8℃穩(wěn)定
【試劑準(zhǔn)備】
洗滌液的準(zhǔn)備
用雙蒸水稀釋洗滌液，例子：10ml洗滌液+190ml雙蒸水。稀釋好的洗滌液在室溫下5天內(nèi)有效。
【樣本的采集和準(zhǔn)備】
這個實驗中使用的樣本是人血清和血漿，如果實驗在樣本采集后的5天內(nèi)進行，則需要儲存在2-8℃，否則，必須于-20℃到-70℃深度凍存。如果樣本是深度凍存的，在使用前，則需要充分混勻，避免反復(fù)凍融。
不推薦使用熱滅活的樣本
【樣本的稀釋】
將10μL樣本跟1ml的樣本稀釋液混勻，并用漩渦混勻器充分混勻。
【實驗步驟】
在開始試驗前，請仔細閱讀試驗說明。結(jié)果的可信度是依賴于嚴(yán)格地按照實驗說明來進行的，鋪板時zui少留1個孔為空白對照（A1）1個陰性質(zhì)控孔（B1）2個臨界質(zhì)控孔（C1+D1）1個陽性質(zhì)控孔（E1）。開始試驗前，請將所有試劑都平衡到室溫
1. 吸取50μL的質(zhì)控品和稀釋過的樣本到相應(yīng)的孔中，留A1孔做空白對照孔
2. 封板
3. 在37±1℃下孵育1小時±5分鐘
4. 當(dāng)孵育完成時，揭去封板片，棄去反應(yīng)液，每孔300μL洗滌液，洗板3次，避免溢出。每孔浸泡的時間都必須＞5秒，zui后拍板將殘留的液滴都拍去。
5. 吸取50μL基孔肯雅溶液1到除了空白對照孔的每個孔中，蓋板
6. 在室溫孵育30分鐘
7. 重復(fù)步驟4
8. 將基孔肯雅溶液2跟鏈霉親和素結(jié)合物混勻10分鐘
9. 吸取50μL基孔肯雅溶液2跟鏈霉親和素的復(fù)合物到除了空白對照孔的每個孔中，蓋板。
10. 室溫孵育30分鐘
11. 重復(fù)步驟4
12. 吸取100μL TMB底物液到每個孔中
13. 避光孵育15分鐘（）
14. 加入100μL終止液到每個孔中，與加TMB底物液時的間隔和順序都必須一樣
15. 用酶標(biāo)儀在加入終止液后30分鐘內(nèi)與450/620nm處檢測
【檢測】
調(diào)整酶標(biāo)儀，以空白對照孔調(diào)零，以450nm處檢測所有孔的吸光度值。
【結(jié)果】
1. 檢測生效的條件
只有以下條件符合，檢測的結(jié)果才能認為的有效的
空白對照孔 吸光度值＜0.100
陰性質(zhì)控孔 吸光度值＜臨界質(zhì)控
臨界質(zhì)控孔 吸光度值0.150-1.300
陽性質(zhì)控孔 吸光度值＞臨界質(zhì)控
如果以上條件不符合的，那么試驗結(jié)果則是無效的，需要重新檢測
2. 結(jié)果的計算
臨界質(zhì)控平均吸光度值的計算，例子：吸光度1：0.39；吸光度2：0.37
（0.39+0.37）/2=0.38
平均吸光度值為0.38
3. 結(jié)果的說明
樣本如果是比臨界值高出10%，則認定為陽性，
樣本如果是在臨界值上下10%之內(nèi)，則認定為灰色區(qū)（推薦在2-4周之后再次檢測新鮮的樣本，如果樣本仍然是灰色區(qū)，可以直接認為是陰性）
樣本如果是比臨界值低出10%，則認定為陰性
4. 結(jié)果的單位
病人樣本平均吸光度值×10 = U
臨界值
例子： 1.216×10 =32U
0.38
臨界值： 10 U
灰色區(qū)：9-11 U
陰性： ＜9 U
陽性： ＞11 U
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。
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