FISH實驗方法及步驟

一.探針變性

將探針在75oC恒溫水浴中溫育5min，立即置0oC，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

二.標本變性

①將制備好的5-8um的玻片標本于50oC培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片標本，將其浸在70～75oC的體積分數(shù)70％甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。

③立即按順序?qū)吮窘?jīng)體積分數(shù)70％、體積分數(shù)90％和體積分數(shù)100％冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。

三.雜交

將已變性或預(yù)退火的DNA探針10μL 滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37oC雜交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進行。

四.洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。

（1） 雜交次日，將標本從37oC溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2） 將已雜交的玻片標本放置于已預(yù)熱42～50oC的體積分數(shù)50％甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。

（3） 在已預(yù)熱42～50oC的1×SSC中洗滌3次，每次5min。

（4） 在室溫下，將玻片標本于2×SSC中輕洗一下。

（5） 取出玻片，自然干燥。

（6） 取200μL復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

五.熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果